细菌的简单染色和革兰氏染色思考题答案

细菌的简单染色和革兰氏染色

(一)实验目的:学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。

(二)实验原理:用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷,能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态,简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。

(三)实验器材

1、活材料:培养12-16h的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)或者枯草杆菌(Bacillus subtilis),培养24小时的大肠杆菌(Escherichia coli)

2、染色液和试剂:结晶紫(附二、(一)、3)、卢哥氏碘液(附二、(一)、4)、95%酒精、蕃红(附二、(一)、5)、复红(附二(一)、2)、二甲苯、香柏油

3、器材:废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

(四)实验方法:

1、简单染色:

(1)涂片:取干净载玻片一块,在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水,按无菌操作法取菌涂片,左边涂苏云金杆菌,右边涂大肠杆菌,做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面,将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面,注意取菌不要太多。

(2)晾干:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

(3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜)

(4)染色:将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上,加复红染色1-2min。

(5)水洗:用水洗去涂片上的染色液

(6)干燥:将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

(7)镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

2、革兰氏染色:

(1)涂片:涂片方法与简单染色涂片相同。

(2)晾干:与简单染色法相同。

(3)固定,与简单染色法相同

(4)结晶紫色染色:将玻片置于废液缸玻片搁架上,加适量(以盖满细菌涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。

(5)水洗:清去染色液,用水小心地冲洗。

(6)媒染:滴加卢哥氏碘液,媒染1min。

(7)水洗:用水洗去碘液。

(8)脱色:将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色,立即水洗。

(9)复染:滴加蕃红复染5min。

(10)水洗:用水洗去涂片上的蕃红染色液。

(11)晾干:将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

(12)镜检:镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应性。

(13)实验完毕后的处理:

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。

②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

(五)实验作业

给出Bacillus thuringiensis和Escherichia coli的形态图,并注明两菌的革兰氏染色的反应性。

(六)注意事项

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以严格规定。

2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。

3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h,E.coli培养24h。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

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